外泌體大家應(yīng)該都很熟悉。1983年，在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了現(xiàn)在生物學(xué)研究領(lǐng)域炙手可熱的“小網(wǎng)紅"——一種特殊囊泡結(jié)構(gòu)，并與1987年正式被命名為“exosome"。

外泌體是指包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡 (30-150nm)，現(xiàn)今，其特指直徑在40-100nm的盤狀囊泡。為細(xì)胞間通訊的重要媒介，它像一個(gè)信使，為細(xì)胞與胞外環(huán)境傳遞信息，保障機(jī)體的正常工作。

越來(lái)越多的科研人員投入到外泌體的研究中，根據(jù)PubMed統(tǒng)計(jì)顯示，最近幾年，外泌體研究呈爆炸增長(zhǎng)。

外泌體的研究離不開細(xì)胞培養(yǎng)。以腫瘤相關(guān)外泌體研究為例，目前，收集腫瘤細(xì)胞外泌體主要有兩種方法：

方法一

使用正常培液養(yǎng)細(xì)胞再換無(wú)血清培液收外泌體。

方法二

直接使用exosome-free FBS配制培養(yǎng)基用于培養(yǎng)細(xì)胞收外泌體。

從現(xiàn)有的一些研究可以看出[1][2][3][4][5]，研究人員更傾向于方法二，也就是使用exosome-free FBS培養(yǎng)細(xì)胞再收上清分離exosomes的方法，至少腫瘤研究方面是這樣的。

相關(guān)文獻(xiàn)[1] Zhou W , Fong M , Min Y , et al. Cancer-Secreted miR-105 Destroys Vascular Endothelial Barriers to Promote Metastasis[J]. Cancer Cell, 2014.

[2] Boelens M , Wu T , Nabet B , et al. Exosome Transfer from Stromal to Breast Cancer Cells Regulates Therapy Resistance Pathways[J]. Cell, 2014, 159(3):499-513.

[3] Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver[J]. Nature Cell Biology, 2015, 17(6):816-826.

[4] Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis[J]. Nature, 2020, 2015，527(7578):329-35.

[5] Melo S A , Luecke L B , Kahlert C , et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer[J]. Nature, 2015, 523(7559):177-182.

所以，接下來(lái)就講講exosome-free FBS——無(wú)外泌體血清。

顧名思義，無(wú)外泌體血清就是外泌體含量極低，低到幾乎沒(méi)有的血清（以粒徑分析結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)），獲得主要有兩種途徑：

直接購(gòu)買商品化的產(chǎn)品

自己DIY制備

如果選擇自己制備無(wú)外泌體血清，常用的方法就是超速離心法。主要有三種策略：（前提是將血清用正確的方法*解凍，分裝，按照實(shí)驗(yàn)需求選擇合適用量進(jìn)行去除外泌體的實(shí)驗(yàn)，血清解凍方法請(qǐng)參照這里??：如何解凍血清才能大程度保證活性？）

將血清與培養(yǎng)基1：4比例稀釋，然后超速離心10000g過(guò)夜收集上清；

直接將血清速離心10000g過(guò)夜收集上清；

180000g離心3-6小時(shí)收集上清。

P.S.其中，離心的過(guò)夜時(shí)間要視情況而定，一般在10-14小時(shí)之間，也可適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間。

需要注意的是，離心后，外泌體會(huì)富集在試管底部，在吸取上層血清的時(shí)候，不要觸碰底部沉淀，避免吸到沉底的外泌體，“一夜回到解放前"。

另外，只吸取80%左右的上層血清，其余的渾濁血清留作其他非外泌體用途細(xì)胞的培養(yǎng)，畢竟血清也挺貴的，避免不必要的浪費(fèi)。

針對(duì)超速離心后的血清，可進(jìn)行粒徑檢測(cè)（離心前樣品和離心后樣品），如果覺(jué)得純度不夠，再把離心后收集的血清做二次離心。

當(dāng)然啦，以上方法也只是我們根據(jù)已有文獻(xiàn)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)得來(lái)的，僅供大家參考，如果有更好的方法，也歡迎在評(píng)論區(qū)和我們交流！

選擇自己手動(dòng)DIY無(wú)外泌體血清，可以在一定程度降低血清的成本，Ausbian血清，高品質(zhì)，實(shí)驗(yàn)更安心，用來(lái)DIY成外泌體實(shí)驗(yàn)專用血清也是不錯(cuò)的選擇。

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